一、差速离心法(又称分步离心法) 用不同的离心速度和离心次数逐步离心不同沉降速度的颗粒的方法称为差速离心。操作时,将含有两种不同颗粒的悬浮液以正常速度离心,使大颗粒下沉,将上清液倒入另一个离心管中,然后增加离心力,离心一定时间,分离小颗粒。差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。差速离心法的优点是:操作简单,离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开,并可使用容量较大的角式转子;分离时间短、重复性高;样品处理量大。缺点是:分辨率有限、分离效果差,沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开,不能一次得到纯颗粒;壁效应严重,特别是当颗粒很大或浓度很高时,在离心管一侧会出现沉淀;颗粒被挤压,离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。
二、速率區帶離心法:根據被分離的顆粒在離心力作用下在梯度液體中的沈降速度不同,經過離心後,不同沈降速度的顆粒處于不同的密度梯度層中,形成幾個分離的樣品區,從而達到相互分離的目的。常用的分離溶液有菲科爾、佩爾科爾和蔗糖。分離靜脈血中的單核細胞。前一種分離溶液將單核細胞(淋巴細胞和單核細胞)分成一層。而Percoll分離液將血液中的淋巴細胞和單核細胞分成兩個梯度層,分別提取。後者的分離效果優于前者,但操作繁瑣。
三、等密度區帶離心法:當不同顆粒存在浮力密度差時,在離心力場下,顆粒或向下沈降,或向上浮起,一直沿梯度移動到它們密度恰好相等的位置上(即等密度點)形成區帶,稱爲等密度區帶離心法。等密度區帶離心的有效分離取決于顆粒的浮力密度差,密度差越大,分離效果越好,與顆粒的大小和形狀無關,但後兩者決定著達到平衡的速率、時間和區帶的寬度。
四、分析性超速離心法①分析型超速離心機的工作原理:分析型超速離心機主要由一個橢圓形的轉子、一套真空系統和一套光學系統所組成。該轉子通過一個柔性的軸連接成一個高速的驅動裝置,此軸可使轉子在旋轉時形成自己的軸。轉子在一個冷凍的真空腔中旋轉,其容納兩個小室:分析室和配衡室。分析室的容量一般爲1ml,呈扇形排列在轉子中,其工作原理與一個普通水平轉子相同。分析室有上下兩個平面的石英窗,實驗室離心機中裝有的光學系統可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沈降的物質,可以通過對紫外光的吸收(如對蛋白質和DNA)或折射率的不同對沈降物進行監測。在分析室中物質沈降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就像一個折射的透鏡,結果在檢測系統的照相底板上産出一個“峰”,由于沈降不斷進行,界面向前推進,故“峰”也在移動,從峰移動的速度可以得到物質沈降速度的指標。
五、密度梯度离心法(又称区带离心法) 该法又分为速率区带离心法和等密度区带离心法。样品在一定的惰性梯度介质中离心沉淀或沉降平衡,颗粒在一定的离心力作用下分布到梯度液体中的特定位置,形成不同区域的分离方法。这种方法的优点是:分辨率好,分离效果好,一次可以得到纯净的颗粒;适用范围广,既能分离沉淀系数差的颗粒,又能分离具有一定浮力密度的颗粒;颗粒不会积压和变形,可以保持颗粒的活性,并且可以防止由于对流形成的区域的混合。缺点是:离心时间长;需要制备梯度液体;操作严格,不宜掌握。